獲1999年度云南省科技進步三等獎；省衛(wèi)生廳科技進步二等獎

楊恒林  高白荷  黃開國

云南省瘧疾防治研究所

 

摘要  目的：培育抗青蒿琥酯惡性瘧原蟲株，為延緩抗性等研究提供抗性品系；比較青蒿琥酯敏感株與抗性株原蟲對9種常用抗瘧藥及2種抗菌素的敏感性。方法： 用人工方法對采自中緬、中老邊境流行的惡性瘧原蟲間斷給予青蒿琥酯刺激，在藥物刺激前及用藥后不同時間用WHO的體外微量法測定惡性瘧原蟲對上述藥物的敏感性(ID₅₀)，并將結(jié)果對比研究。結(jié)果：用藥前及用藥后68和129d青蒿琥酯ID₅₀分別為9.6、30.6、85.1nmol/L，分別較用藥前升高2.2、7.9倍。停藥后67dID₅₀降到52.9nmol/L，下降37.9%。氯喹、甲氟喹、奎寧、本芴醇對抗性株與敏感株的ID₅₀無明顯變化，而蒿甲醚、雙氫青蒿素、萘酚喹、諾氟沙星(氟哌酸)、甲硝唑?qū)剐灾甑腎D₅₀與敏感株相比上升達4倍以上，咯萘啶上升1.9倍。結(jié)論：可用人工方法建立抗青蒿素類惡性瘧原蟲，其抗性產(chǎn)生速度明顯快于抗性下降速度?？骨噍镧盒辕懺x對蒿甲醚、雙氫青蒿素、諾氟沙星、甲硝唑存在明顯交叉抗性； 對咯萘啶有交叉抗性征兆；對氯喹、甲氟喹、奎寧、萘酚喹和本芴醇無交叉抗性。

    關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲，抗青蒿琥酯蟲株，抗瘧藥

 

抗氯喹惡性瘧的出現(xiàn)與擴散嚴(yán)重的阻障著全球抗瘧工作的進程， 為克服這技術(shù)難題WHO及有關(guān)國家和組織加強替代藥物的開發(fā)研究，近40年來對30多萬種化合物進行篩選。目前可替代氯喹用于惡性瘧治療的藥物僅有我國研制的青蒿素類藥物、咯萘啶及國外開發(fā)的甲氟喹。最近研究證實， 我國惡性瘧原蟲對咯萘啶及青蒿素類的敏感性在緩慢下降，在泰緬、泰柬邊境地區(qū)用標(biāo)準(zhǔn)甲氟喹治療惡性瘧，已有50%的病人難治愈，提示惡性瘧原蟲對新抗瘧藥產(chǎn)生抗性是不可避免的，抗性產(chǎn)生速度明顯快于新藥開發(fā)速度，迫切需要開展延緩抗性，保護新抗瘧藥的研究。

 

材料和方法

1、蟲株來源  惡性瘧原蟲FccSM/YN株采自云南思茅(位于中老、中緬邊境地區(qū))，按Trage (1976)蠟燭缸培養(yǎng)法，建立體外傳代培養(yǎng)。

2、抗藥性的誘發(fā)  采用青蒿琥酯體外劑量遞增間隔接觸方法進行抗性培育，每周采制薄血膜3次，吉氏染色后計數(shù)每1000個紅細(xì)胞內(nèi)原蟲數(shù)。培養(yǎng)物接觸藥液48小時后，用營養(yǎng)液離心洗滌2次，約經(jīng)16.7d原蟲繁殖率恢復(fù)正常， 然后再加大濃度重復(fù)前步驟繼續(xù)培養(yǎng)，每次藥物濃度增高1.6－3.2pmlo/L，直至原蟲對青蒿琥酯產(chǎn)生抗性。

3、藥物制備  青蒿琥酯靜脈注射粉劑由桂林第二制藥廠提供。藥粉先用5% 碳酸氫鈉1ml溶解，然后用雙蒸水稀釋到所需濃度經(jīng)0.3μ微孔濾膜過濾滅菌后-20℃儲存?zhèn)溆?。臨用前用培養(yǎng)液按實驗所需濃度再作稀釋。

4、測定板制備  無藥測定板及氯喹、阿莫地喹、甲氟喹、奎寧測定板由WHO提供， 各板A井為對照，B井藥量分別為1、0.25、2及4pmol。青蒿琥酯測定板及其各種藥物測定板按以往介紹方法方法制備。本芴醇、萘酚喹、諾氟沙星、甲硝唑、 測定板1及12井為無藥對照，第2井藥量分別為0.32、0.125、1.25、1.2pmol，3－11 井依次倍增；測定青蒿琥酯敏感株的雙氫青蒿素測定及青蒿琥酯測定板第2井的藥量均為0.16pmol，測定抗性株測定板的藥量分別為1.6及0.62pmol/井，3－11井依次倍增。 測試采用Rieckmann體外微時法。測試前用5%山梨醇對瘧原蟲作同步化處理， 將其稀釋到20,000－60,000個/μl血，加5倍培養(yǎng)基稀釋，混勻加入測定板各藥井，從低濃度至高濃度每井加50μl，同時測定2組，培養(yǎng)24－30h收獲，以對照井為基數(shù)計算各濃度井中的裂殖體抑制率[(1-藥物井的裂殖體數(shù)/對照井?dāng)?shù)) ×100] 以回歸法計算ID₅₀。

5、判斷標(biāo)準(zhǔn)  青蒿琥酯對惡性瘧原蟲的ID₅₀較親代成倍上升，能在40nmol/L以上濃度中生長，可認(rèn)為對該藥生產(chǎn)了抗性，相應(yīng)的稱為惡性瘧原蟲青蒿琥酯抗性株。如該株對其他某種藥物的敏感性明顯下降(ID₅₀較親代成倍上升)， 可認(rèn)為對該藥存在交叉抗性。[NextPage]

 

結(jié)    果

1、青蒿琥酯抗性培育  瘧原蟲在接觸藥物前測得青蒿琥酯ID₅₀為9.6nmol/L，接觸藥物培養(yǎng)68d(上藥4次，藥物濃度為12.8pmol/L)，其ID₅₀增高至30.6nmol/L， 為親代的3.2(30.6/9.6)倍，隨著藥物濃度的增高，其抗性水平亦繼之上升，培養(yǎng)到129d( 上藥7次，藥物濃度為16pmol/L)，其ID₅₀值增高至85.1nmol/L，約為親代的9倍。當(dāng)停止接觸藥物，在無藥液中培養(yǎng)67d后，其ID₅₀值降至52.9nmol/L，下降37.9%。

2、青蒿琥酯敏感與抗性株原蟲對蒿甲醚、雙氫青蒿素、 咯萘啶、本芴醇、萘酚喹、諾氟沙星、甲硝唑、氯喹、甲氟喹和奎寧的比較共測定46組，其中敏感株、抗性株各23組，各對照組抑制率為52－71%。抗性株與敏感株相比，青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素、 咯萘啶、 諾氟沙星及甲硝唑?qū)剐灾甑?/SPAN>ID₅₀(nmol/L)較敏感株分別高出7.7(85.1/9.6)、4.5(80.5/14.6)、4.4(72.6/13.4)、 1.9(170.6/59.0)、7.1(9818.2/1215.9)、及26.6(35879.6/1303.3)倍；氯喹、奈酚喹對抗性株的ID₅₀較敏感株依次高出23.2%(112.0/90.6)及34.9%(119.4/88.5)倍； 甲氟喹(63.2/67.9)、奎寧(272.4/238.8)、本芴醇(66.8/72.3)無明顯變化。

 

討    論

在青蒿琥酯抗性培育中，瘧原蟲在接觸藥物后68d和129d，ID₅₀上升到親代的3.2倍和8.9倍，停止藥物刺激后67d，ID₅₀僅下降37.9%，但仍為親代的5.5倍。 提示惡性瘧原蟲可在藥物壓力的刺激誘導(dǎo)下，在較短時間內(nèi)產(chǎn)生抗性，其抗性產(chǎn)生和發(fā)展速度明顯快于抗性下降速度。對此應(yīng)影起高度重視。

上述8種抗瘧藥和2種抗菌素對以上敏感株(親代)和抗性株的對比研究結(jié)果顯示， 甲硝唑、諾氟沙星、蒿甲醚、雙氫青蒿素、咯萘啶、對抗性株的ID₅₀較敏感株成倍上升；對氯喹、甲氟喹、奎寧、萘酚喹、本芴醇無明顯變化。 提示抗青蒿琥酯惡性瘧原蟲對甲硝唑、諾氟沙星、蒿甲醚、雙氫青蒿素存在明顯的交叉抗性， 對咯萘啶有交叉抗性征兆；抗青蒿琥酯惡性瘧原蟲對氯喹、甲氟喹、奎寧、 萘酚喹和本芴醇無交叉抗性。鑒于青蒿素類藥物皆具有共同的抗瘧活動基因， 抗青蒿琥酯惡性原蟲對同類藥物中的蒿甲醚、雙氫青蒿素有明顯交叉抗性事實， 在培育抗青蒿琥酯惡性原蟲的同時，培出了惡性瘧原蟲抗蒿甲醚和抗雙氫青蒿素株。從理論上講該類藥物與上述無交叉抗性的藥物伍用對延緩抗性可能具有一定的潛在價值，值得加強研究。 本研究和以往的研究結(jié)果提示在現(xiàn)場廣泛使用青蒿素類藥物的情況下， 惡性瘧原蟲遲早會對該類藥物產(chǎn)生抗性。WHO對此十分重視，已將延緩惡性瘧原蟲抗性，保護新抗瘧藥作為研究發(fā)展方向。本項目作為抗性的基礎(chǔ)研究對抗性機理探索、聯(lián)合用藥方案的篩選、復(fù)方劑型的開發(fā)等研究具有重要意義。（以上內(nèi)容已在中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志和中國寄生蟲病防治雜志發(fā)表9篇）

 

 

注：轉(zhuǎn)載請注明出處，謝謝合作