獲1993年度衛(wèi)生廳表揚獎

獲得者：李學忠  金淑仙  楊品芳  余文祥

云南省瘧疾防治研究所

 

提要：本文對采自我省不同瘧區(qū)162份干血滴，包括惡性瘧51例與間日瘧111例，采用由當?shù)胤蛛x的惡性瘧原蟲可溶性抗原進行ELISA 試驗，并用食蟹猴瘧原蟲（P.cynomolgi）替代抗原作對比，結果顯示使用兩種抗原的陽性符合率基本一致，但是用P.f抗原的幾何平均滴度顯著高于用P.c抗原者（371.76，324.68；P<0.05），用P.f抗原測惡性瘧患者血清陽性幾何平均滴度顯著高于用P.c抗原（527.8，383.71；t=1.72P<0.05）。在單純間日瘧區(qū)采集的49份血樣使用P.c抗原的抗體陽性幾何平均滴度顯著高于P.f抗原，前者為388.84，后者為250.79（t=2.91 P<0.01.）

 

為提高微量酶聯(lián)免疫吸附試驗的靈敏度及應用于現(xiàn)場調查的準確性，本文用體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲制備抗原進行試驗，并同時用食蟹猴瘧原蟲抗原作比較。

 

材料和方法

一、抗原制備：

1、同種抗原：所用惡性瘧原蟲系由思茅縣一男性青年患者血中分離獲得，  用Trager等的燭缸法培養(yǎng)傳代。

2、替代抗原：食蟹猴瘧原蟲自感染黃猴體內獲得。當寄生率均達10%左右并以裂殖體和大滋養(yǎng)體期為主時收集，經2,000rpm離心20分鐘，棄上清后再用PBS pH7.4洗滌2次，壓積細胞用過量重蒸水充分溶解2次，即得呈棕褐色的瘧原蟲，加入0.01M PBS pH7.45ml，混勻后于冰浴中用本溪產250W超聲細胞粉碎器處理5次（每次1分鐘，間隔1分鐘），取出后經10000rpm4℃冷凍離心30分鐘，上清即為可溶性抗原，用紫外光吸收法測定蛋白含量惡性瘧原蟲抗原為1.26mg/ml，食蟹猴原蟲抗原為3.09mg/ml，測試最適稀釋度后即包被平板待用。

二、結合物制備：根據(jù)駱加里的戊二醛過碘酸鈉簡易標記法進行標記。羊抗人IgG為本所自制，辣根過氧化物酶系上海東風試劑廠產品，RZ=3，標記后加等量甘油混勻保存，測試結合物最適稀釋度，以消光值為1. 0 時的滴度作為最適稀釋度，結果為1:4000（純濃度為1:8000）。

三、血樣來源：162份陽性干血滴分別采自惡性瘧兼有間日瘧流行的瘧區(qū)( 下稱混合瘧區(qū))113份，以及單純間日瘧流行的瘧區(qū)49份。健康人干血滴采自己控制流行20 余年的思茅城區(qū)托兒所及小學共87份，每例試驗對象均經原蟲血片鏡檢，并由耳垂前取血蘸在濾紙上使自然擴展至徑為1.2cm，晾干后放入有干燥劑的塑料袋，冷藏帶回實驗室4℃保存。

四、試驗方法：按1978年WHO酶標學習班講義進行，采用上海塑料三廠生產的40孔聚苯乙烯反應板作載體，辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG，底物使用鄰苯二胺（OPD）過氧化氫（H₂O₂）系統(tǒng)，每份血樣同時用兩種抗原平行測試，結果判讀用MR590型Micro ELISA Minireader，選用490nm波長。[NextPage]

 

結    果

一、兩種可溶性抗原最適稀釋度的測量：用pH9.6碳酸緩沖液分別將兩種抗原作1:50～1:12,800倍比稀釋后順序包被平板，按常規(guī)操作用2份惡性瘧與1份間日瘧陽性血滴作1:100稀釋平行測定PBS為對照，選擇消光值1.0時的稀釋度為最適稀釋度，結果兩種抗原均為1:1000。

二、兩種抗原陽性閾值的確定：按常規(guī)測試，所采集的162份陽性干血滴及87份健康人干血滴，以第一個稀釋度（1:100）的消光值為準，選擇上述兩種血樣消光值差異最顯著點作為閾值。試驗結果，陽性值定為消光值0.4以上（含0.4）。

三、用兩種抗原同法平行測試162份陽性干血滴的抗體陽性率，P.f抗原為99.38%，（161/162），P.c抗原為97.53%（158/162），兩者無顯著差異（P>0.05），但P.f 抗原的陽性幾何平均滴度顯著高于P.c抗原，分別為371.76和314.25（P<0.05）。另外用P.f 和P.c抗原檢測87例健康血樣，假陽性率為1.14%和8.04%，前者低于后者。

四、兩種抗原的特異性：為進一步了解兩種抗原的特異性，將51例惡性瘧以及在111例間日瘧中采自混合瘧區(qū)的62例，采自單純間日瘧流行區(qū)的49例分別用兩種抗原測試，結果抗體陽性率基本一致，但p.f抗原對同種血樣的陽性GMRT顯著高于p.c 抗原（527.8，383.7T；t=1.72，P＜0.05）。而p.c抗原檢測單純間日瘧區(qū)49份血滴的陽性幾何平均滴度高于p.f抗原（288.84，250.79；t=2.91，P＜0.01）；而有p.f 抗原檢測混合瘧區(qū)62份間日瘧血滴抗體陽性幾何平均滴度顯著高于用P.c抗原（386.8，220.06；t=4.49，P＜0.01），可能與這些患者中有些以往患過惡性瘧殘存有p.f抗體有關。

 

討    論

應用ELISA檢測瘧疾抗體，國內外已有不少報道，Spencer等應用體外培養(yǎng)p.f 制備的抗原在薩爾瓦多試驗表明ELISA是瘧疾流行病學調查研究的一種靈敏方法；Quakyi等證明p.f抗原對同種陽性血清滴度高于異種；王捷等應用p.f抗原檢測3.7份確診瘧疾病人的瘧疾抗體，兩者陽性符合率為90.2%，其中惡性瘧陽性符合率為94.3%， 間日瘧符合率為84.9%。表明對惡性瘧的陽性符合率明顯高于間日瘧。目前對p.f抗原與p.c抗原進行ELISA的比較尚不多見。為比較兩種抗原的使用價值，本研究應用從思茅縣分離的一株惡性瘧原蟲培養(yǎng)，僅用寄生率約10%、壓積細胞約3ml 的蟲血制備的可溶性抗原，其效價即與用35ml寄生率為10%的P. cynomolgi蟲血制備的抗原基本相同，均為1:1000左右，制備本株p.f抗原、蛋白含量較低且未經同步性處理，說明本株p.f抗原活力較高。

本試驗使用p.f抗原進行ELISA對87份健康兒童血樣的測試，符合率達98.9%，而P.c抗原對這87份健康人血樣進行平行測試，符合率只有92.0%，假陽性率為8.1%(7例)。 對162例確診患者干血滴的試驗，結果用P.f抗原的陽性符合率為99.4%(161/162)，其中一例假陰性患者是出生三個月的嬰兒，于發(fā)病當天采血，出現(xiàn)假陰性反應，可能是免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對病原體的刺激不不能產生應答以及發(fā)作時間短、IgG抗體尚未產生到足以被這種方法查見的水平。如果排除這一例，則p.f抗原對該批確診陽性患者的血滴，抗體陽性符合率為100%，而用p.c抗原的符合率僅為96.9%，兩種抗原的陽性符合率有顯著差異；P＜0.025。進一步證實P.f抗原對檢出混合病區(qū)病人血清抗體的靈敏度較高。

應用血清學的方法進行瘧疾流行病學研究，抗體滴度的變化是一項重要指標,作為動態(tài)的研究，抗體滴度水平的變化比抗體陽性率更為靈敏。本次試驗用p.f抗原檢測p.f患者血滴，抗體陽性GMRT顯著高于P.c抗原，證明P.f抗原對同種瘧疾有較高的特異性。反之，p.c抗原對間日瘧患者血樣有較高的交叉免疫反應,顯示P.c抗原與P.v 抗原可能有較多的共同成份。據(jù)此，我們初步認為，在混合瘧區(qū)使用p.f抗原優(yōu)于p.c抗原，而單純間日瘧區(qū)應用p.c抗原亦有較高的敏感性。

 

 

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